این پایان نامه در قالب فرمت word قابل ویرایش ، آماده پرینت و ارائه به عنوان پروژه پایانی میباشد

زمينه و هدف: رتینوبلاستوما از تومورهای داخل چشمی شایع در کودکان می باشد. اگرچه در درمان رتینوبلاستوما پیشرفت وجود دارد ولی شکست در درمان و مرگ و میر در کشور های توسعه یافته چشم گیر می باشد. مهمترین علت این شکست مقاومت دارویی و عوارض آن می باشد.هدف این مطالعه ارزیابی اثر متقابل داروی SD-208 داروی ضد سرطان و افزایش بیان TGIF2LX در سلول های Y79 رده سلولی رتینوبلاستوما می باشد.

روش پژوهش: در اولین مرحله ارزیابی پروتئین TGIF2LX ،وکتور PEGFP-N1 که شامل تمام سکانس ژن TGIF2LXبود به سلول های Y79 ترانسفکت شد و بیان آن توسط میکروسکوپ UV و Realtime RT-PCR ثابت شد. همراه با ترانسفکشن سلول با دز های  مختلف داروی SD-208 ( (0,1µM,2µMتیمار شد.سپس الگوی بیان 5miRNA  شامل Let7g,18a,34a,22,20a در سلول های ترانسفکت شده تیمار شده و بدون تیمار در مقایسه با سلول های ترانسفکت نشده مورد بررسی قرارگرفت.       

يافته‌ها:ما متوجه شدیم که تمام miRNA ها در سلول های ترانسفکت شده تیمار شده و با داروی SD-208 افزایش بیان داشتند p<0.05 بجز miRNA20a.

نتیجه گیری:این اولین مطالعه است که نشان داد که SD-208 بیان ژن هموباکس وmiRNA های متفاوت را افزایش می دهد که نقش تومورساپرسوری در رتینوبلاستوما را دارند.همچنین نتایج ما پیشنهاد می کند که استفاده همزمان TGIF2LXو SD-208 می تواند روش جدید در درمان رتینوبلاستوما باشد. فصل 1:مقدمه و بیان مسئله    1

1‌.1‌رتینوبلاستوما    2

1‌.1‌.1‌    اپیدمیولوژی    2

1‌.1‌.2‌    پاتوژنز    3

1‌.1‌.3‌    ویژگی های کلینیکی وتشخیصی    5

1‌.2‌ تاریخچه خانوادگی    5

1‌.3‌ تشخیص    5

1‌.4‌ ارزیابی قبل از درمان    6

1‌.5‌ درمان    6

1‌.6‌ مکانیسم مولکولی سرطان    9

1‌.6‌.1‌    مسیر پیام رسانی TGFβ     9

1‌.6‌.1‌.1‌    خانواده لیگاند های TGFβ    11

1‌.6‌.1‌.2‌    رسپتور نوع 1و2 ( TGFβRI,II)    11

1‌.6‌.1‌.3‌    فسفریلاسیون SMAD    12

1‌.6‌.2‌    تنظیم پیام رسانی TGFβ    12

1‌.6‌.3‌    دخالت پیام رسانیTGFβ  در سرطان    13

1‌.6‌.4‌    ژنهای همئوباکس(Homeobox)    14

1‌.6‌.4‌.1‌    ساختار ژن های همئوباکس    14

1‌.7‌    نقش ژن های همئوباکس (Homeobox) در ایجاد سرطان    17

1‌.8‌ miRNA        18

1‌.8‌.1‌    بیوژنز miRNA ها و نحوه مهار ترجمه    19

1‌.9‌ miRNA و سرطان    20

1‌.10‌ miRNA ابزاری برای شناسایی و تشخیص سرطان    21

1‌.11‌ miRNA ودرمان سرطان    22

1‌.12‌    بیان مسئله و اهمیت پژوهش    23

1‌.13‌    اهداف پژوهش    24

1‌.13‌.1‌    هدف اصلی    24

1‌.13‌.2‌    اهداف ویژه    24

1‌.13‌.3‌    هدف کاربردی    25

فصل 2: بررسی متون    26

2‌.1‌ بررسی متون مرتبط با موضوع    27

فصل 3:مواد و روش ها    32

3‌.1‌ مواد شیمیایی و آنزیم ها    33

3‌.1‌.1‌    پلاسمیدوسویه باکتری    35 3‌.1‌.1‌.1‌    خصوصیات پلاسمید    36

3‌.1‌.1‌.2‌    خصوصیات میزبان    37

3‌.2‌ روش ها    37

3‌.2‌.1‌    کشت باکتری    37

3‌.2‌.1‌.1‌    مواد و وسایل مورد نیاز برای کشت باکتری    37

3‌.2‌.1‌.2‌    طرز تهیه محیط کشت LB مایع    38

3‌.2‌.1‌.3‌    گلیسرول استاک    38

3‌.2‌.2‌    روش انجام   miniprepاستخراج DNA  پلاسمیدی از باکتری    39

3‌.2‌.2‌.1‌    بررسی کمی وکیفی DNA پلاسمیدی    41

3‌.2‌.3‌    هضم آنزیمی پلاسمید های استخراج شده    45

3‌.2‌.4‌    کشت سلولی    46

3‌.2‌.4‌.1‌    محیط کشت    46

3‌.2‌.4‌.2‌    سرم جنینی گاوFBS    47

3‌.2‌.4‌.3‌    تهیه محیط انجاد از سلولها    47

3‌.2‌.4‌.4‌    خصوصیات سلولهای مورد استفاده شده در این پایان نامه    48

3‌.2‌.5‌    تعیین منحنی کشندگی انتی بیوتیک G418    48

3‌.2‌.6‌    منطبق سازی سلولها    48

3‌.2‌.7‌    ترانسفکشن سلولهای Y79  با وکتور پلاسمیدی نوترکیب pEGFP-TGIF2LX    49

3‌.2‌.8‌    انتخاب سلولهای مثبت    50

3‌.2‌.9‌    بررسی بیان ژن TGIF2LX در سلول های ترانسفکت شده در سطح mRNA بوسیله Realtime RT-PCR            51

3‌.2‌.9‌.1‌    محافظت از RNA    52

3‌.2‌.9‌.2‌    استخراج RNA    55

3‌.2‌.9‌.3‌    تیمار نمونه RNA باآنزیم دئوکسی ریبونوکلئاز  I    59

3‌.2‌.9‌.4‌    سنتز DNA مکمل(cDNA)    60

3‌.2‌.9‌.5‌    PCR(Polymerase chain reaction) واکنش زنجیره ای پلیمراز    64

3‌.2‌.9‌.6‌    واکنش Realtime PCR    68

3‌.2‌.9‌.7‌    تجزیه و تحلیل داده های حاصل از واکنش Realtime RT-PCR    77

3‌.2‌.10‌    بررسی بیان eGFP-TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله Western blot    78

3‌.2‌.10‌.1‌ الکتروفورز عمودی SDS-PAGE    78

3‌.2‌.10‌.2‌ رنگ آمیزی SDS-PAGE    84

3‌.2‌.10‌.3‌ وسترن بلاتینگ    86

3‌.2‌.11‌    بررسی میزان تکثیر سلولی بوسیله تجزیه نمک تترازولیوم    90

3‌.2‌.11‌.1‌ بررسی اثر بیان افزایشی TGIF2LX سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل    90

3‌.2‌.11‌.2‌ بررسی اثر متقابل SD-208 و بیان افزایشی TGIF2LX سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل    91

3‌.2‌.11‌.3‌ پروتکل شمارش سلول    92

3‌.2‌.12‌    مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیانTGIF2LX, miRNA Let7g,18a,34a,22,20  در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل به وسیله Real time RT-PCR    92

فصل 4: نتایج و یافته ها    96 4‌.1‌Mini prep   و هضم DNA  پلاسمیدی جهت تایید وکتور نوترکیب    97

4‌.2‌ بررسی بیانTGIF2LX  در سطح mRNA    98

4‌.2‌.1‌    نتیجه بررسی کیفی و کمی RNA    98

4‌.2‌.2‌    بررسی کیفی cDNA    99

4‌.3‌ بررسی بیان TGIF2LX  در سلولهای ترانسفکت شده    101

4‌.3‌.1‌    مطالعه بیان TGIF2LX  در سلولهای ترانسفکت شده Y79  در مقایسه با نمونه های کنترل بوسیله میکروسکوپ            101

4‌.3‌.2‌    تایید بیان واضح ژن GFP-TGIF2LX توسط Realtime RT- PCR    102

4‌.3‌.3‌    مطالعه بیان ژن TGIF2LX در سلول های ترانسفکت شده با وکتور حاوی GFP-TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله Western Blot    104

4‌.3‌.4‌    مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیانTGIF2LX  در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل        105

4‌.4‌ بررسی اثر بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79    105

4‌.4‌.1‌    نتایج ازمایش (MTT)Microculturetetrazolium Test    105

4‌.4‌.2‌    بررسی اثر متقابل SD-208 و بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل    106

4‌.5‌ بررسی بیان miRNA Let7g,18a,34a.22,20a در سلولهای ترانسفکت شده و کنترل    108

4‌.6‌    مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیان miRNA Let7g,18a,34a.22,20  در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل    109

4‌.7‌ Ct در واکنش Realtime PCR    110

فصل 5: بحث، نتیجه گیری و پیشنهادها    113

5‌.1‌ بحث    114

5‌.2‌ تاثیر بیان افزایشی TGIF2lX بر روی Cellular Viability در رده سلولی Y79    116

5‌.3‌ تاثیر دارویSD-208  بر روی Cellular Viability در رده سلولی Y79 بیان کننده افزایشی TGIF2LX و کنترل    117

5‌.4‌ اثر SD-208 بر روی بیان TGIF2LX در رده سلولی Y79 ترانسفکت شده در مقایسه با کنترل            118

5‌.5‌ اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیانmiRNA های مورد مطالعه    118

5‌.5‌.1‌    اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNAlet7g در رده سلولی Y79    118

5‌.5‌.2‌    اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA18a در رده سلولی Y79    119

5‌.5‌.3‌    اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA34a در رده سلولی Y79    119

5‌.5‌.4‌    اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA22 در رده سلولی    119

5‌.5‌.5‌    اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA20a در رده سلولی Y79    120

5‌.6‌ نتیجه گیری    120

       7.5 پیشنهاد ها ............................................................................................ ..........................121

منابع و مراجع    122

پیوست ها    131 فهرست اشكال

صفحه

شکل ‏11: چشم راست کودک دارای لوکوکوریا (چشم گربه ای)    2

شکل ‏12: مدل 2 ضربه ای رتینوبلاستوما    4

شکل ‏13: چگونگی فعال شدن گیرنده توسط TGFβ    10

شکل ‏14: چگونگی فعال یا مهار شدن مسیر TGFβ    11

شکل ‏15: مدل بیوژنز miRNA و نحوه عملکرد آن    20

شکل ‏31: شمایی از روش ترانسفکشن    50

شکل ‏32: تبدیل DEPC به اتانول و دی اکسید کربن در طی اتوکلاو    55

شکل ‏33: نمایش پیام های فلورسنت در 40 چرخه Realtime PCR    69

شکل ‏34: ساختار رنگ SG (سایبرگرین)    71

شکل ‏35: نمایش جذب رنگ SG(سایبرگرین) که منجر به افزایش پیام فلورسنت در طی واکنش PCR می شود.    71

شکل ‏36: نمایش کاربرد منحنی ذوب جهت تشخیص و تمایز محصولات اختصاصی و غیر اختصاصی واکنش PCR    73

شکل ‏37: شکل داروی SD-208    92

شکل ‏38: شمای کلی از Realtime RT-PCR جهت miRNA    93

شکل ‏41: نتیجه Mini Prep و سپس هضم انزیمی DNA پلاسمیدی استخراج شده ازباکتری حاوی  وکتور پلاسمیدی نوترکیب pEGFP-TGIF2LX و pEGFP- N1..    97

شکل ‏42: مورفولوژی سلول های سرطانی  Y79با بزرگنمایی 10 توسط میکروسکوپ نوری    98

شکل ‏43: کیفیت RNA  استخراج شده را نشان می دهد که بر روی آگاروز 2/1% ران شده است.    99

شکل ‏44: محصولات RT- PCR برای ژن GAPDH.برای اطمینان از کیفیت RNAاستخراج شده ازرده  سلولیY79  و Y79-N  و Y79-X  پس از ساختcDNA  با پرایمر های اختصاصی GAPDH    100

شکل ‏45: محصولاتRT- PCR  برای ژن TGIF2LX بر روی آگاروز 2%.     101

شکل ‏46: مطالعه سلولهای Y79 بعد از 21 روز دوز انتخابی G418 است  که توسط میکروسکوپ نوری (الف)، ) UV ب و ج) را نشان میدهند. بزرگنمایی X10    102

شکل ‏47: منحنی ذوب برای پرایمر TGIF2LX و GAPDH    102

شکل ‏48: نتایج Realtime RT-PCR    103

شکل ‏49: محصولات Realtime RT- PCR  برای ژن TGIF2LX بر روی آگاروز 2%.    103

شکل ‏410: مطالعه بیان TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله آنتی بادی پلی کلونال بر علیه این پروتیئن    104

شکل ‏411: اثر داروی SD-208 را بر روی بیان TGIF2LX با Realtime RT-PCR    105

شکل ‏412: نتیجه MTT بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل که به صورت معنی داری درصد Cell Viabillity کاهش یافته بود. p<0.05    106

شکل ‏413: اثر داروی SD-208 بر روی رده های سلولی  Y79,Y79-N. p>0.05    107

شکل ‏414: رابطه یcell viability در سلول های Y79وY79-NوY79-X درDMSO,untreate و دز 1و2 ماکرومولار SD-208 در  Optimum time(48h) نشان میدهد.P<0.05    108

شکل ‏415: منحنیmelting peak  مربوط به پرایمر  miRNA U6,18a وNTC    108

شکل ‏416: تغییرات بیان miRNA  های مورد مطالعه در این پژوهش، در سه رده سلولی Y79, Y79-N1 , Y79-TGIF2LX بوسیله Realtime RT-PCR    109

شکل ‏417: تغییرات بیانmiRNA  های مورد مطالعه در این پژوهش را در Optimum dose (µM2) سه رده سلولی Y79, Y79-N1 , Y79-TGIF2LX بوسیله Realtime RT-PCR    110

فهرست جداول

صفحه

جدول ‏31: ليست کليه مواد مورد نیاز و شرکت های سازنده    33

جدول ‏32: فهرست دستگاه ها و وسایل مورد استفاده در این پژوهش    34

جدول ‏33: شرایط هضم آنزیمی    45

جدول ‏34: اجزاء واكنش سنتز cDNA    63

جدول ‏35: توالی و مشخصات پرایمر ها    67

جدول ‏36: اجزاء واكنش RT-PCR    67

جدول ‏37: برنامه زمانی و دمایی لازم جهت انجام واکنشRT-PCR    68

جدول ‏38: مواد لازم به ازای هر واکنش Realtime RT-PCR    76

جدول ‏39: برنامه ی زمانی و دمایی لازم جهت انجام واکنش Realtime RT-PCR    76

جدول ‏310: مرحله افزودن آنزیم PolyA Polymerase    94

جدول ‏311: مرحله سنتز رشته اول cDNA    94

جدول ‏312: مرحله تکثیر به روش Realtime PCR    95

جدول ‏313: دما ومدت زمان جهت Realtime PCR miRNA    95

جدول ‏41: غلظت و میزان خلوص اسید نوکلئیک های حاصل از سلول ها    99

جدول ‏42:  Ct حاصل از Realtime PCR برای ژنهای   GAPDH , TGIF2LX    111

جدول ‏43:  Ct  حاصل از Realtime PCR برای miRNAU6, Let7g, 18a, 34a, 22, 20a    112

فهرست پیوستها

صفحه

پیوست ‌أ : نقشه پلاسمید PEGFP-N1    132

پیوست ‌ب: نقشه پلاسمید PEGFP-TGIF2LX    133

پیوست ‌ج: میزان تغییرات بیان ژن های مورد مطالعه در رده سلولی Y79,Y79-N به همراه standard error و p-Values در سریال دز    134

پیوست ‌د: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن TGIF2LX در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values    136

پیوست ‌ه: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA Let7g در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values    137

پیوست ‌و: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA 18a در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values    138

پیوست ‌ز: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA 34a در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values    139

پیوست ‌ح: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA 22 در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values    140

پیوست ‌ط: جداول مربوط به میزان تغییرات بیان ژن miRNA 20a در رده سلولی Y79-X,Y79-N در سریال دز به همراه standard error و p-Values    141