فهرست مطالب

عنوان                                                                                  صفحه

بخش اول: دست كاريهاي ژني در ماهيان

مقدمه.......................................

1-1- به كار گيري پروموتر از ژن ماهيان........

2-1- بيان ژن هورمون رشد ماهي در باكتري.......

3-1-  انتقال ژن به تخم ماهي از طريق ميكروپيل با ميكروپيپت

4-1- انتقال ژن از طريق اسپرم با انكوبه كردن آن در سيستم بافري   

5-1- انقال ژن از طريق اسپرم با الكتروپورشن در سيستم بافري

6-1- انتقال ژن  به تخم ماهي از طريق الكتروپورش

7-1-  انتقال ژن به تخم ماهي از طريق ميكروپيل با ميكرواينجكشن 

8-1- بررسي امكان وراثت ژن منتقل شده به نسل ها بعد  

بخش دوم : دست كاريهاي كروموزومي در ماهيان

1-2- دست كاريهاي جنسي.......................

1-1-2- دست كاريهاي جنسي با تكنيك ژينوژنز....

2-1-2- دست كاريهاي مجموعه كروزومي به وسيله تكنيك اندروژنز

2-2- پلوئيدي................................

1-2-2- تريپلوئيدي...........................

2-2-2- تتراپلوئيدي...........................

بخش سوم: كلونينگ

مقدمه.......................................

1-3- ايجاد كلون به وسيله دوژينوژنز متوالي.....

2-3- كلون كردن به وسيله تركيبي از اندروژنز و ژينوژنز

3-3- جابجايي هسته............................

4-3- جابجايي سلولهاي سوماتيك جنيني به جنين ديگر.

5-3- دورگه گيري..............................

4- منابع....................................

بخش اول: دست كاريهاي ژني در ماهيان

مقدمه:

يكي از زمينه هاي كه امروزه بيوتكنولوژيست ها روي آن تحقيق مي كنند ايجاد گونه هاي ترانسژنيك است. طبق تعريف ترانسژنيك موجودي است كه، داراي DNA  نو تركيبي باشد. به طوري كه در ژنوم آن موجود ژن نو تركيب بيان مي شود. بيان ژن خارجي يكي از جنبه هاي توليد ترانسژنيك و انتقال DNA به زاده هاي  هدف بعدي مي باشد. در اين زمينه تكنيك ميكرواينجكش در انتقال ژن به تخم مهره داران اولين بار به وسيله گوردون (Gordon) و همكاران در سال 1980 گزارش شد. در اين تكنيك يك لوله مؤئين شيشه اي را براي وارد كردن DNA نو تركيب به پيش هسته نريا با سيتوپلاسم تخم لقاح يافته موش به كار گرفتند. در همين سال ميكروانجكش مستقيم DNA نو تركيب در شرايط آزمايشگاهي جهت ايجاد حيوانات ترانسژنيك مورد استفاده قرار گرفته است. طوري كه ژن را از اين طريق وارد تخم هاي لقاح نيافته يا لقاح يافته موجوداتي نظير جنين توتياي دريايي،‌ موش،‌ قورباغه، مگس سركه، خرگوش و خوك كرده اند (Brem 1988) در سال 1985 زئو (Zhu) و همكاران ژني شامل پرتومتالوتيونين موش و ژن هورمون رشد انساني را به ناحيه مركزي صفحه زاياي تخم هاي لقاح يافته ماهي طلايي تزريق كردند و قسمتي از اين ژن را در DNA ماهيان مشاهده كرند. در همين سال روكونس (Rokkones) تكنيك ميكرواينجكشن دو مرحله اي بر روي تخم آزاد ماهيان را شرح داده است. در اين تكنيك ابتدا به كمك يك وسيله نوك تيز فلزي در قطب حيواني سوراخي ايجاد شده و از طريق اين سوراخ محلول حاوي DNA  نو تركيب به كمك پي پت ريز تخم شدند به طوري كه به كيسه زرده وارد نشوند. پس از 14 روز پلاسميدهاي كامل را مشخص كردند. چوروت (Chourrout) و همكاران در سال 1986 روش فوق را بر روي قزل آلاي قهوه اي رنگ به كار برند با توجه به وجود DNA خارجي همراه با ملكولهاي DNA ميزبان پيشنهاد شده كه اين ژن به داخل ژنوم ماهي وارد شده است. محققان به ورش دستي يا از طريق هضم آنزيمي از  جمله با تريپسن كوريون را برداشته و تزريق ميكرواينجكشن انجام دادند. در همين سال اوزاتا (Ozata) ماهي كوچك مدوكا را به عنوان مدلي براي ترانسژنيك مطرح كرد. او پلاسميدهاي حاوي ژن كريستالين جوجه را به هسته تخم ها از طريق ميكرواينجكشن وارد كرد. به علت كوريون سفت در تخم لقاح يافته تعدادي از ماهيان استفاده از ميكرواينجكشن مشكل و مستلزم اتلاف وقت زيادي است. به همين منظور  روشهايي جهت غلبه بر اين مشكل به كار گرفته شده است. از جمله در سال 1988 بريم (Brem)  و همكاران ژن هورمون رشد انسان را به كمك وكتور مناسب از طريق ميكروپيل به صفحه زاياي تخم هاي تيلاپيا تزريق كردند و رشد بچه ماهيان طي 90 روز بررسي شد. مشابه اين تحقيق توسط فلت چر (Fletcher) و همكاران در همين سال بر روي ماهي آزاد اتلانتيك انجام شد. همچنين تكنيكهاي ديگر شامل الكتروپورشن (Electroporation) شليك ذرات ژن Shatagun بر روي تخمك و طراحي ليپوزوم جهت ورود به زرده تخم انجام شده است. ميكر واينجكشن نياز به مهارت زيادي دارد و از طرفي سرعت آن كم و هزينه و تجهيزات آن زياد است و مستلزم زحمات و زمان زيادي براي ايجاد تعداد زيادي از ما هيان ترانسژنيك است علاوه بر اين از ديگر مشكلات آن اين است كه در تخم هاي القاح يافته اغلب ماهيان هسته به وسيله ميكرسكوپ قابل روئيت نيست بنابراين DNA را به سيتو پلاسم  تزريق مي كنند.

در مجموعه تحقيقات انجام شده، ميزان باقي ماندگي جنين هايي كه مورد تزريق قرار گرفته اند بين 50 تا 80 درصد گزارش شده است. و كارآيي ميزان بيان ژن بين 3 تا 70 درصد بوده است. باقي ماندگي جنين ها و كارايي بيان ژن وابسته به فاكتورهايي نظير سيستم بافري، غلظت DNA  و روش هاي مورد استفاده در تزريق مي باشد. لذا در مراحل بعدي غلبه بر اين مشكلات مورد توجه قرار گرفت به طوري كه ضمن ساده كردن تكنك و كم كردن هزينه ها كارآيي را افزايش مي دهند تا در عمل بتوان در تكنولوژي تكثير و پرورش آبزيان تعداد زيادي از ماهيان ترانسژنيك را ايجاد كرد. بنابراين روش استفاده از اسپرم جهت انتقال ژن مطرح شد. اگر چه مفهوم بكارگيري اسپرم به عنوان يك ناقل مسئله جديدي نيست بلكه در سال 1971 براكت (Brackett) با وارد كردن ژن خارجي به اسپرم خرگوش و در سال 1987 فريمن (Fareeman) بر روي ماكيان اين تحقيق را انجام داده اند و در سال 1989 لويترانو (Lavitrano) اين تكنيك را بر روي موش به كار گرفته است. در سال 1992 كهو (Khoo) تكنيك استفاده از اسپرم به عنوان ناقل را جهت وارد كردن ژنهاي جديد به ماهي زبر به كار گرفت. همچنين در سال 1993 ايكسي (Xie) و همكاران جزئيات انتقال ژن از طريق اسپرم به كمك التروپورشن (Electroporation) بر روي ماهيان لوچ (Loach) و كاراس (Crucian) را شرح داده اند. در همان سال (سين) Sin و همكاران انتقال ژن به ماهي چنوك (Chinook) را با همين تكنيك شرح دادند. در  اين نوشتار جزئيات دستكاريهاي ژني در ماهيان با ذكر مثالهايي بررسي شده است.

1-1- به كار گيري پروموتر از ژن ماهيان

گزارشهاي اندكي در ارتباط با تحقيقات به كارگيري پروموتر از ماهي در دسترس است. در ماهي قزل آلاي رنگين كمان دو فرم مشابه از ژنهاي متالوتيونين بنام B,A وجود دارد. اگر چه پروموترژن B قادر به بيان  ژن  گزارشگر در محيطهاي  كشت سلولي  است. ولي درباره اين ويژگي پروموترژن B در سلولهاي ماهي اطلاعات كمي وجود دارد. به منظور طراحي و كتورهاي مناسب براي ما هي و مطالعه تنظيم بيان ژن در داخل بدن و شرايط آزمايشگاهي پروموترن ژن B متالوتيونين  ماهي قزل آلا جدا شد. پس از PCR نقش آن در بيان ژن در لاينهاي سلولي انسان و ماهي توسط هونگ (Hong) به كار گرفته شد. به همين منظور وكتور بنام PtMTb – CAT كه داراي 6/4 كيلوباز است طراحي گرديد. حدود 261 حفت باز وكتور مربوط به پروموترژن B متالتيونين قزل آلاي رنگين كمان (tMTb) كيلو باز آن ژن كلرامفنيكل استيل ترانسفراز (CAT) و سيگنال پلي ادنيلاسيون ويروس SV40 و همچنين 7/2 كيلو باز آن قطعه اي مربوط به پلاسميد PUC₁₈ بوده است همچنين طراحي آن بر پايه ساختمان pBL – CAT تكميل شده بود. به طوري كه طراحي BL پرايمري داراي سكانس اوليگونكلئوتيدي بر اساس رديف نكلئوتيدهاي سمت 5 از 250 تا 221 ژن MTb ماهي قزل آلا بوده و داراي محل ويژه اي جهت برش توسط آنزيم EcoRI بوده است. همچنين در ساختمان پلاسميد ptMTb – CAT قطعه 261 جفت بازي پروموتر tMTb در جلوي ژن CAT در ساختمان  CAT pBL- قرار گرفته است. در كنار اين چهار وكتور ديگر طراحي گرديد، كه شامل pBL-CAT₂-1 كه در آن پروموتر تيميدين كيناز (TK) ويروسي در بالا دست ژن CAT قرار داده شده بود. pBL-CAT₃-2 بر اساس pBL-CAT₂ كه در آن پروموتر TK برداشته بود طراحي شد pTK-CAT₂E-3  كه در پلاسيميد PBL-CAT₂ تعداد 72 جفت باز تكراري از اينهنسر SV40(Enhancer) به صورت دوبل به ابتداي ژن CAT اضافه شده بود. PhMT IIA-4 كه تعداد 850 جفت باز داراي محل ويژه برش Hind III/NcoI از پروموتر آن متالوتيونين II_A انساني (Hmt_IIA) به ژن CAT در ساختمان
 pBL-CAT₃  اضافه شده بود اين وكتورها به روي 4 لاين سلولي ماهي و يك لاين انساني به كار گرفته شدند. طوري كه در آن سلولها با ميزان 5/3 پيكومولار از DNA پلاسميد آلوده شدند جزئيات نتايج در جدول شماره يك آمده است.